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一、產品概述

1.1 m6A-seq概述

m6AN6-methyladenosineRNA腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾,是真核生物mRNA上最常見的一種轉錄后修飾。m6A修飾在肥胖、癌癥、突觸信號傳遞、精子發育、卵子發生、干細胞分化、減數分裂、晝夜節律等生物學過程發揮重要作用。m6A修飾過程中有三大類酶發揮重要作用,分別是WritersErasersReadersWritersm6A甲基轉移酶(m6A methyltransferase )主要包括METTL3METTL14WTAP等。去甲基化酶包括FTOALKBH5等。識別甲基化酶包括YTH結構域蛋白、hnRNP以及eIF等。m6A殘基分布在mRNA5UTR3UTR,核心motifG[G/A]A*CU*表示潛在的m6A位點)。主要影響mRNA的可變剪切、調節mRNA的翻譯以及影響mRNA的表達和降解。m6A-seq是基于免疫共沉淀的原理結合測序在全轉錄組水平上定位m6A修飾。

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1.2實驗流程

1.提取Total RNA并用Oligo-dT磁珠富集mRNA。

2.通過超聲破碎或化學試劑將mRNA進行片段化。

3.取片段化的mRNA一部分作為input進行測序;另一部分用帶有磁珠的m6A抗體免疫沉淀具有m6A修飾的mRNA片段。

4.將帶磁珠的抗體洗脫掉,留下m6A修飾的mRNA片段,隨機引物構建cDNA文庫,加接頭進行測序。

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Wen J, Lv R, Ma H, et al. Zc3h13 Regulates Nuclear RNA m 6 A Methylation and Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal[J]. Molecular Cell, 2018, 69(6):1028.

m6A是真核生物mRNA豐度最高的一種修飾,通過影響mRNA的穩定性、可變剪切、轉運和翻譯來動態的調節mRNA。ZC3H13是一種鋅指蛋白,在介導細胞核中RNA的m6A甲基化發揮重要作用。在小鼠的胚胎干細胞中敲除Zc3h13降低了mRNA的整體m6A水平。Zc3h13敲除之后,大部分的WTAP、 Virilizer和Hakai轉移到細胞質中,表明Zc3h13對于Zc3h13-WTAP-Virilizer-Hakai復合物的細胞核定位是必需的。敲除Zc3h13、WTAP、Virilizer或Hakai,影響了mESCs的干性,進而促進小鼠胚胎干細胞分化。簡言之,Zc3h13在細胞核中錨定WTAP、Virilizer和 Hakai復合物進而核中促進核中RNA的m6A甲基化,維持了mESC的自我更新。

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Yoon K J, Ringeling F R, Vissers C, et al. Temporal Control of Mammalian Cortical Neurogenesis by m6A Methylation.[J]. Cell, 2017, 171(4):877.

m6A被一種甲基化轉移酶復合物Mettl3/Mettl14所催化,是一種最普遍mRNA內部修飾。在胎鼠腦中敲除Mettl14導致了m6A修飾的清除,延長了RGCs細胞周期,胚胎期的皮層推遲了出生后。Mettl3的knockdown導致的現象與Mettl14敲除類似。胎鼠皮層的m6A測序揭示了富集m6A修飾的mRNA與轉錄因子、神經發生、細胞周期、神經分化有關以及發生了m6A的mRNA會被降解。m6A修飾也調控人前腦類器官的神經發生。通過人和鼠皮質神經發生過程中含有m6A修飾的mRNA比較,研究人員發現這些發生修飾的轉錄本與人腦紊亂的基因相關。簡言之,本研究通過基因干擾和m6A測序揭示了哺乳動物神經發生過程中轉錄調控的表觀機制。

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