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一、產品概述


   
   1.1什么是ChIP-seq


       ChIP-seq技術結合染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)與高通量測序,是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具,通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。
       

       1.2產品功能

                     

      ChIP-seq技術是將ChIP與高通量二代測序結合,從基因組范圍內檢測組蛋白、轉錄因子等蛋白質結合的DNA區段。研究轉錄因子及其他與染色質相關的蛋白如何影響表觀調控,檢測在一些生物過程與疾病中,DNA與蛋白質相互作用調控基因表達的重要性。結合生物信息學分析,能夠找到轉錄因子下游調控的靶基因,為進一步闡明生物學機制提供依據。
       
      1.3技術優勢 


       1、全基因組覆蓋:ChIP-Seq可在全基因組范圍單堿基水平對蛋白結合位點進行篩選與鑒定。

       2、高靈敏度:每個樣本可獲得數百萬條的序列標簽,可發現研究基因組上稀有的蛋白結合位點。

       3、高精確率:可獲得高水平的信噪比數據,準確區分真實事件與噪音,精確定位蛋白結合位點。
       
      1.4實驗簡介 


       1.4.1實驗原理 

        

      首先通過染色質免疫共沉淀技術(ChIP)特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,并對其進行純化與文庫構建;然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。
       應用:(1)判斷DNA鏈的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾;(2)檢測RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點的精確定位;(3)研究組蛋白共價修飾與基因表達的關系;(4)CTCF轉錄因子研究。        

       1.4.2 實驗流程

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       獲得樣品后,首先是細胞核的提取。細胞樣品無需此操作,組織樣品要經過研磨處理,將組織塊處理成單個細胞或細胞核。隨后是蛋白質和DNA的交聯,使得轉錄因子緊密的結合在與DNA相互作用的位置,便于后續操作。緊隨著是DNA片段化處理,這一步將DNA隨機打斷,既照顧了測序儀的讀長要求,也使得測序更加精確。理想的片段長度為1-3個核小體(150-500bp)。片段化處理之后的樣品,經過特異性的抗原抗體結合反應被免疫沉淀下來,而沒有結合的DNA蛋白質復合體則被洗掉。
      IP下來的DNA通過連接測序接頭和可以識別的條碼序列,被制備成了可以用于二代測序的文庫。同時片段化后的
總DNA也被制備成文庫,作為分析的參考。


1.5 項目執行時間


      實驗執行時間和生物信息分析執行時間。
      從樣品的檢測合格開始,到建庫測序及數據分析出結果并完成報告,大約需要40天:
      從實驗啟動到文庫制備完成需要5個工作日,如果樣品需要進行蛋白質表達量鑒定和組織完整性鑒定,則額外需要3個工作日,共計8個工作日。前期質檢結果我們會在第四個工作日之前以書面的形式通知銷售和科研助理。



二、樣本準備



2.1 樣本要求


2.1.1 新鮮細胞樣品
   

若客戶送樣為培養中的新鮮細胞,我們會對細胞進行細胞計數和蛋白質DNA的交聯。對于進行轉錄因子(polII、CTCF等除外)的ChIP實驗,我們會分出部分細胞用于鑒定。具體要求為:

a.       Histone ChIP細胞量>20million,TF ChIP細胞量>100million

b.      客戶樣品、抗體、樣品的完整信息單

c.       新鮮細胞需要我公司進行細胞固定,請務必于送樣前一天通知實驗人員,準備時間進行細胞處理



2.1.2 已固定細胞
   

若客戶自己進行細胞的固定,請務必嚴格按照銷售提供的實驗操作步驟進行。對于進行轉錄因子的ChIP實驗,需要準備3份樣本,其中2份是固定后的樣本,用于ChIP實驗,1份是未固定細胞,用于檢測目標轉錄因子在細胞核里的表達量。具體送樣要求為:

a.       用于ChIP實驗的細胞Histone細胞量每份>10million,TF細胞量每份>50million

b.      與ChIP-seq實驗同一批次培養的未固定細胞沉淀2million(管內不應要有液體殘留)

c.       客戶樣品、抗體、樣品的完整信息單



2.1.3 組織樣品
 

a.       所送動物組織質量應當>100mg,并且組織新鮮。

b.      建議取材后用生理鹽水進行漂洗,以去除血漬和污物,并剔除結締組織          等非研究組織。

c.       將樣品分割成100 mg左右的小塊,樣品分割和處理時應在冰上進行, 防止樣品降解。

d.      為確保實驗的順利,建議樣品備份1-2份,以防備部分樣品降解重新取材、制備或送樣,耽誤時間。

e.       客戶樣品、抗體、樣品的完整信息單。

f.       若需要長途運輸,請將組織樣品液氮速凍,干冰運輸。



三、樣本運輸


3.1樣品包裝

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3.2 樣本標識


      在容器表面寫清樣品名稱,且與信息單上一致。不建議用油性筆直接在管壁或管蓋上寫樣品名稱等信息,最好將樣品名稱等 各種信息寫在標簽紙上,貼在管壁,外面再用透明膠帶纏繞一圈(防止標簽紙沒有粘牢脫落,導致 樣品無法應用)。


3.3 樣本運輸條件


     1、運輸過程中需要添加的干冰和冰袋的量與季節、運輸時間長短、泡沫盒的 薄厚有關(為更有利于保溫,盡量選用大塊的干冰,建議將樣品用透明膠固定于冰袋上,防止干冰揮發導致樣品降解)。 
    2、所有樣品盡量保證48小時內運達。
    3、銷售請于寄送前告知實驗室人員和科研助理,所有樣品不支持到付。


四、嘉因生物參與完成的典型案例


2.1 轉錄因子的ChIP-seq案例


       EglN2 associates with the NRF1‐PGC1α complex and controls mitochondrial function in breast cancer. (EMBO J, 2016) 
       EglN2/PHD1是一個對乳腺癌發生有重要作用的氧感知器(oxygen sensor)。越來越多的研究表明在氧感知(oxygen sensing)和線粒體作用上兩者有功能上配合(cross talk),并且兩者在維持腫瘤生長上都有很關鍵的作用。這篇文章向我們展示了EglN2敲除會降低在常氧和缺氧狀態下乳腺癌中線粒體的呼吸。進一步整合分析RNA-seq及EglN2在缺氧狀態下ChIP-seq數據 我們發現:NRF1在EglN2激活的基因上有motif 富集,這暗示了NRF1可能是EglN2的共結合因子(binding partner)。進一步,我們通過ChIP-seq數據驗證了 EgLN2和NRF1的相互結合。機制上,通過在染色質上形成EglN2/PGC1alpha/NRF1激活復合體,EglN2激活了FDXR的轉錄并保持了線粒體的功能。進一步,FDXR作為EglN2的一個下游靶基因(effector),導致了乳腺癌的發生in vitro/ in vivo. 作者的發現暗示了EglN2調控了ERalpha陽性乳腺癌中線粒體的功能。

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2.2 組蛋白修飾的ChIP-seq案例


      Conditional Knockin of Dnmt3a R878H inituates acute myeloid leukemia with mTOR pathway involvement  (PNAS, 2018) 
      Dnmt3a是造血系統中表觀遺傳學的修飾基因和癌癥的抑制基因。Dnmt3a 878H是急性髓樣白血病(AML)中最常見突變體。本研究采用條件性敲擊的方法發現Dnmt3a R878H不足以引起AML。通過單細胞測序(single-cell RNA-seq)結合甲基化DNA免疫沉淀測序(MeDIP-seq)發現Dnmt3a R878H/WT和Dnmt3aWT/WT的低甲基化和超甲基化區域,通過基因注釋發現不同甲基化區域(DMRs)的富集通路參與多能性干細胞和慢性粒細胞白血病(CML)調控,聯合RNA-seq發現Dnmt3a R878H/WT誘導的低甲基化有助于mTOR上調。MeDIP分析顯示白血病細胞的mTOR基因主體低甲基化。通過RNAi等發現mTOR的上調使CDK1的水平增加,CDK1介導EZH2的磷酸化水平增加來抑制H3K27me3的甲基化水平。通過ChIP-seq分析Dnmt3aR882H/WT和Dnmt3aWT/WT的H3K27me3發現Dnmt3aR882H/WT的H3K27me3甲基化水平和富集程度低于Dnmt3aWT/WT。最終明確mTOR pathway的激活作為一個疾病機制的關鍵調節劑并且可以通過mTOR來抑制Dnmt3a突變體相關的白血病的潛在治療效應。

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五、其他應用案例


       案例1 轉錄因子的ChIP-seq

       FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 activates SEPALLATA2 but inhibits CLAVATA3 to regulate meristem determinacy and maintenance in Arabidopsis. (PNAs, 2016)
       植物分生組織對植物組織和器官的形成是必要的。轉錄因子FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 (FHY3)是已知的擬南芥生長階段發揮多重作用,但是它的功能在生殖生長期是不知道的。作者通過對fhy3突變體進行表型分析發現,FHY3在花分生組織決定和莖端分生組織的維持中都具有重要作用。通過ChIP-seq和RNA-seq數據分析發現在花發育過程中有238個FHY3直接結合并轉錄調控的靶基因(其中138個在fhy3-68突變體中是轉錄上調的,100個是轉錄下調的)。根據特異結合位點,作者發現了52個花特異的FHY3靶基因,其中63%(33個基因)在fhy3-68突變體中是上調的,進一步顯示FHY3在花發育中的轉錄抑制作用。作者進一步證實了CLV3、SEP1和SEP2都是FHY3的靶基因。在莖尖分生組織中,FHY3直接抑制CLV3,從而調控WUS來維持干細胞池。在花分生組織中,FHY3直接抑制CLV3,而且激活了SEP2來最終促進花分生組織決定。而且,作者通過遺傳分析證實了兩個分生組織建立和維持的關鍵因子WUS和CLV3作用于FHY3的下游。


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圖4.1 案例1 實驗圖

       

       案例2
       H2A monoubiquitination in Arabidopsis thaliana is generally independent of LHP1 and PRC2 activity. (Genome Biology, 2017)
      文章通過擬南芥H3K27me3 和H2AK121ub的ChIP-seq實驗和數據,回答了一個懸而未決的植物領域表觀遺傳的問題,到底組蛋白修飾H2AK121ub是否需要轉錄因子PRC2的活性。經典模型認為,PCR2介導的H3K27me3是 招募PRC1形成H2AK121ub的不可或缺的一步,也就是說PCR2的活性是H2AK121ub形成所必須的。但是作者發現,在很多情況下,廣泛存在的組蛋白修飾H2AK121ub與H3K27me3的分布無關(H3K27me3是由PCR2介導發生的)。通過一系列后續實驗,作者認為在很大程度上來說 H2AK121ub的形成與PRC2的活性無關。

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圖4.2 案例2 實驗圖

       

       案例3
       SETDB1 modulates PRC2 activity at developmental genes independently of H3K9 trimethylation in mouse ES cells (Genome research, 2015,IF=11.3)
       小鼠胚胎干細胞中SETDB1獨立調節H3K9me3過程中發育相關基因PRC2活性 
       SETDB1是一種促進H3K9 甲基化修飾的組蛋白甲基轉移酶。作者首先用ChIP-seq對H3K9me3做了4個重復,結合前人的SETDB1ChIP-seq 實驗數據進行比對,得到了兩種SETDB1peaks位點:solo peaks和ensemble peaks。ensemble peaks位點附近有H3K9me3峰值,而solo peaks附近沒有。對solo peaks位點靶基因進行GO分析,發現大部分基因富集在神經發育調節功能中,而這部分基因又與核心蛋白復合體(PRC2)相互關聯。PRC2結合位點附近一般伴隨著豐富的H3K27me3修飾,H3K27me3修飾會抑制SETDB1修飾H3K9me3。通過SETDB1敲除,發現H3K27me3減少,神經分化得到促進。

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圖4.3 案例3 實驗圖

    


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