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ATAC-seq
ATAC-seq

     一 產品概述

       ATAC-seq技術檢測染色質開放區域,即Tn5酶可接近的DNA區域,將快速又敏感的表觀遺傳現象可視化。使用具有50,000個細胞的簡單兩步方案捕獲開放的染色質位點。
      轉座子優先并入一般沒有核小體(無核小體區域)或暴露DNA段的基因組區域。因此,基因組中某些基因座序列的富集表明該區域不存在核小體,處于DNA結合蛋白等核機器能進入的松散暴露狀態,提供有關染色質區段轉錄活躍狀態的信息。
       ATAC-seq實驗的測序部分通常將產生數百萬次可以成功回帖到參考基因組的高通量測序reads。每條reads指向在實驗期間發生的一次切割事件在基因組上的位置。然后對回帖到基因組上的reads進行計數,并創建具有堿基對分辨率的信號峰值(peak)。
      在實驗過程中DNA可接近的基因組區域(染色質開放區域)含有更多的測序reads(因為這是轉座酶優先作用于這些位置)。這些開放位點區域可以進一步分為各種調節元件類型:啟動子,增強子,絕緣子等。通過進一步的信息整合,如峰與轉錄起始位點的距離,產生處于開放區域作用下的基因列表;或計算開放區域內的高傾向結合某種特定蛋白的堿基序列(motif),得到活躍基因的上游調控因子,提供全基因組轉錄因子發生的信息。
ATAC-seq技術可以進行樣本之間差異的染色質開放位點的比較,通常并不單獨使用。作為檢測表觀遺傳-染色質開放狀態現象的方式,與樣本基因表達譜緊密相連,從靶標基因的表觀狀態關聯到表達水平,具有強大的數據挖掘作用。此外,通過關聯基因組、外顯子,染色質免疫共沉淀(組蛋白修飾或轉錄因子結合)測序信息,形成:表觀調控-基因組-基因表達的完整調控鏈。

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ATAC (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)

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攜帶著接頭(Adapter)的轉座酶復合物進入到染色質開放區域,將處于松散狀態的DNA片段化同時末端加上接頭。特定成對的PCR引物在DNA片段擴增同時末端加上index,經分選純化后即為可測序文庫。

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Seq (Sequencing)


   二  什么情況下使用ATAC-seq

       1)從機制研究的角度,闡述老師關心的生物通路,細胞反應,細胞表型和疾病是否與表觀遺傳學的調控相關。開疆破土的思維!
       2)快速的決定 表觀遺傳修飾 是否在老師感興趣的課題中 起到一定作用 (主要是通過 比較 疾病組和正常組的ATACseq的差異,從而推測表觀遺傳是否在疾病中起到一定作用)

       3)通過ATACseq定義的open chromatin區域 ,再結合motif 分析,識別哪種轉錄因子參與了基因表達調控(對于抗體質量不好的TF,尤其有效)

     “ 我要研究的是具體的生物學問題,研究某個基因的上下游調控機制,那些揭示基因組普遍規律的文章不適合我。”

       ATAC-seq適合你,它能回答以下三個問題:
      1. 找調控某一生物學過程的關鍵轉錄因子
      2. 找哪個轉錄因子調控了我感興趣的基因
      3. 找我感興趣的轉錄因子調控的靶基因
      

三  嘉因生物完成的各類ATAC-seq實驗

       目前嘉因生物已經可以在各種樣本類型下 完成ATAC-seq實驗,包括 新鮮細胞,冰凍組織,各類植物組織,真菌 和 微量細胞。

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                                     新鮮細胞


冰凍組織.png 

                             冰凍組織


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                                          擬南芥組織


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                                            生菜組織

大豆疫霉菌.png

                                            大豆疫霉菌

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                                        微量細胞


四 ATAC-seq案例

腫瘤發育研究
       Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling(PLoS Genet 2015 Feb)
       取果蠅眼內觸角圓盤組織野生型和對應的不同時期的 Rasv12 + scrib-/- mutation tumor樣本,用ATAC-seq檢測染色質開放圖譜存在的差異。結果發現tumor和正常組織之間,早期腫瘤和晚期腫瘤之間,開放染色質區域存在數以千計的peak差異,說明處于開放狀態的染色質區域有所區別。腫瘤中許多enhancer和promoter被激活,結合基因表達譜RNA-seq數據,證實染色質開放區域與臨近基因的表達水平相關。
在染色質開放區域內掃描motif來尋找可能存在的轉錄因子調控,發現 AP-1 和Stat92E對于原癌基因表達和腫瘤的生長發育具有關鍵的調控作用。

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腫瘤機制研究
       Nfib Promotes Metastasis through a Widespread Increase in Chromatin Accessibility(cell, 2016 July)
選擇人小細胞肺癌研究促進癌癥擴散轉移的背景機制。比較原發性和肝轉移性的小細胞肺癌細胞之間的差異。兩種類型分別來自于4只小鼠重復共計8個樣本,利用ATAC-seq,發現NFI家族轉錄因子富集在差異的染色質開放位點中,預示著NFI家族轉錄因子在調控腫瘤細胞轉移中扮演著重要角色。在染色質高開放性位點區域伴隨著Nfib拷貝數量增大,且Nfib在侵襲性原發性腫瘤和轉移性腫瘤內高表達,Nfib表現出維持染色質及遠端調控區域開放和促進神經基因表達的功能,說明了Nfib對促進癌細胞增殖和遷移的重要作用及調控機制。

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腫瘤細胞特性研究
       Authentication and characterisation of a new oesophageal adenocarcinoma cell line: MFD-1. (science reports, 2016 April)
      從55歲的男性病人中獲取了一種新的食管癌細胞系:MFD-1,采用ATAC-seq方法與經典的食道癌細胞系OE33和人食管上皮細胞HET1A比較差異,進行MFD-1癌細胞特性研究,繪制MFD-1染色質開放位點圖譜。和正常上皮細胞相比,MFD-1特異的染色質開放位點顯著富集著CTCF、NFY、Meis3 、Nrf2 的motif,且這些位點附近基因富集在和上皮癌及消化道腫瘤相關的功能分組內。
結合全基因組測序(WGS)和表達譜測序(RNA-seq)技術,發現細胞系中4 個基因(ABCB1, DOCK2, SEMA5A 和TP53)存在5個突變位點,提供了MFD-1的基因表達特性。說明MFD-1能作為一種代表性的臨床前原發性食管癌模式細胞系,可用于對應突變類型的研究。

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