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RNA-seq
RNA-seq

一、 產品概述

 

1.1什么是轉錄組測序(包括mrnaseq ribo-zero rnaseq

1、mRNA-seq:指利用高通量測序技術對cDNA進行測序從而得到一個樣品中幾乎所有RNA的信息。

2、Ribo-zero RNAseq:使用RiboZero方法去除核糖體RNA,然后再對其他的RNA(如:LncRNA,mRNA和small RNA)進行建庫并測序的方法。

 

1.2產品功能

1、通過mRNA-seq,不僅能夠篩選差異表達基因,還可以推測mRNA的結構、識別可變剪位點及cSNP(編碼序列單核苷酸多態性)、解析RNA等。

2、Ribo-zero rnaseq:對于RNA質量不高的樣本,比如部分降解或者降解程度很嚴重的RNA,使用此方法測序效果較好。

 

1.3技術優勢

 

1.3.1 轉錄組測序相比于microarray

microarray的本質是核酸雜交,只不過是同時進行上萬個核酸雜交而已,因此microarray是個相對封閉的系統,只能檢測序列已知的片段的濃度。芯片制造商們通常只針對果蠅、線蟲、小鼠和大鼠等實驗室經典模式生物生產芯片,目前有許多物種還沒有參考基因組或者DNA芯片,如果研究者不能提供所要檢測的部分序列就無法構建相應芯片。而轉錄組測序是個開放的系統,能檢測到那些沒有參考序列的片段,并且給出序列,從而發現一些以前沒有檢測到的基因(發現新序列)。轉錄組測序在本質上是PCR,先用PCR的方法構建測序文庫(SOLiD的油包水PCR,Solexa的橋式PCR),隨后再以“邊合成邊測序”或者“連接介導的測序”,得到序列信息。由于在構建測序文庫的過程中有PCR放大的過程,因此相對靈敏度較高(需要高覆蓋倍數的測序深度配合)。此外,與DNA芯片相比RNA-seq還具有更多優勢,DNA芯片是在熒光強度的基礎上報告表達的相對值,而由于RNA-seq能夠一邊讀取一邊對轉錄本進行計數,它能夠直接測出轉錄本的豐度。總的來說,RNA-seq不僅能夠揭示轉錄本結構和剪切事件,還能夠識別融合基因、等位基因特異性突變等等。

1.3.2 Ribo-zero RNAseq 相對于常規RNA-seq

Ribo-zero RNAseq與常規RNA-seq進行建庫前都需要去除核糖體RNA,常規RNA-seq使用Poly(T)探針和mRNA上的Poly(A)尾巴結合,然后,用磁珠來回收這些吸附在探針上的帶poly(A)尾巴的mRNA,把mRNA洗脫下來之后,就可以進行下面的建庫。但是這個方法有一個缺點,就是它對總RNA質量的要求非常高。一般會要求總RNA的RIN值在8.0以上。如果總RNA有一定程度的降解,那么Poly(T)探針所能吸附到的都是靠近mRNA的3’端的那些片段,而mRNA的5’端的那些斷片,就會大部分地被丟失。所以,測序得到的結果就會有很大的偏向性。另外,如果是要測的是長鏈非編碼RNA,也就是LncRNA,也是不能用Poly(T)方法來做的。因為大部分的LncRNA沒有Poly(A)尾巴,所以就不能用Poly(T)的探針來吸附。Ribo-zero RNAseq方法設計了吸附核糖體RNA的探針,用探針來吸附核糖體RNA。再用帶鏈霉親合素的磁珠來吸附這些帶生物素標記的探針。磁珠被磁鐵吸附在管壁上。而其它的RNA,包括mRNA、LncRNA、和small RNA等RNA則留在上清液當中。實驗這樣設計,就得到了2個結果。第一點,就是對RNA樣本的質量要求不再是很高。部分降解的RNA、或者降解程度很嚴重的RNA都可以用RiboZero的方法去除核糖體RNA。第二點,就是那些不帶Poly(A)尾巴的LncRNA,使用RiboZero方法也可以被測序測到了。所以,現在市場上,大部分的LncRNA建庫,都是通過RiboZero的方法,去除核糖體,接下來再進行建庫。綜上所述:Ribo-zero 方法測序相比于RNA-seq具有高精確度和重復性好的優勢,此外,還可以對RNA質量不高的樣本進行測序。使用Ribo-zero 方法測序還可以對LncRNA進行測序。

 

1.4 實驗簡介

1.4.1實驗原理

RNA-seq即轉錄組測序技術,就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量測序技術把它們的序列測出來。反映出它們的表達水平。

應用:

轉錄本結構研究(基因邊界鑒定、可變剪切研究等),轉錄本變異研究(如基因融合、編碼區SNP研究),非編碼區域功能研究(Non-coding RNA、microRNA前體研究等),基因表達水平研究以及全新轉錄本發現。

1.4.2實驗流程

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獲得樣品后,樣品提取總RNA,根據客戶的需求,比如測mRNA、ncRNA還是smallRNA等,對總RNA樣品進行處理。處理好的RNA再進行片段化,然后反轉錄成cDNA,獲得cDNA文庫,接著建庫測序。


二 嘉因生物參與的案例


Distinct Transcriptional andAlternative Splicing Signatures of Decidual CD4+ T Cells in Early HumanPregnancy,發表于Frontiers in Immunology. 2017影響因子6.5

 

貢獻說明:嘉因生物團隊完成了低樣本量RNA-seq實驗和各種轉錄組生物信息學分析,并發現了pCD4T細胞和dCD4 T 細胞的基因標志物(genesignature)和同源基因異構標志物(splicing signature

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